《天下第一镖局》讲述的故事发生在清康熙年间，吴三桂驾崩之后，大将马宝为了将陈圆圆和其孙子护送归隐，开始寻求江湖势力保护，天下第一镖局——清平镖局意外担此重任，并经历了与多方势力的殊死混战，最终九死一生。

京城女镖师沈飞燕（吴晓敏 饰），应通州富商刘大鹏（隋抒洋 饰）之邀前来护镖，据刘家总管介绍，近来刘府经常出现莫名其妙的怪事，刘母（柏含 饰）疑心妖孽作祟，镖师王振威（周群达 饰）派小来与飞燕一同前往。刘家人对飞燕的到来十分欢迎，盼她早日降妖，小少爷灵儿（辰辰 饰）一句看似信口拈来的童言引起飞燕的警觉，他说每当半夜有个叔叔来府上教他画画，由于家中怪事迭出，老夫人对不务正业的灵儿进行了责罚，不料当即受到神秘白衣人（李振涛 饰）的警告。白衣人自称他是被刘家害死的冤魂，再三劝告飞燕不要插手刘家的事，经过一番周密侦查，沈飞燕终于弄明白了一起惊天冤案……

冯金（王岗 饰）来到了天下镖局，花重金聘请王振威（周群达 饰）保镖，而他需要保护的人正是冯金的干女儿沈飞燕（吴晓敏 饰）。沈飞燕的父亲沈荣（姬麒麟 饰）发现王振威所使出的招式正是他苦苦追寻了几十年的“霸王追魂枪”，于是邀请王振威的父亲王兆兴（姜大卫 饰）来府上一聚。哪知道两人之前有着牵扯不清的恩恩怨怨，一言不合竟然相约在十里坡比试武艺。 比武当日，沈荣倒在了王兆兴的追魂枪下，而令王兆兴感到疑惑的是，自己的枪并未此中沈荣，这也就意味着有人从中作梗，借刀杀人。王振威掩护父亲离开，自己却缴械投降，因为他深信为人正直的父亲不可能干出此事，王振威被投入了大牢，所幸得到沈飞燕的搭救重获自由，就此展开了对于事件真相的调查。